La recherche biomédicale est très complexe. C’est un monde tout à fait particulier où l’échelle du temps n’est pas tout à fait la même que la nôtre. Il faut beaucoup de temps pour mener à bien des recherches, et surtout pour obtenir les résultats que l’on escompte. L’école de l’ADN est un lieu où les associations de malades, les lycéens, et tous ceux qui le veulent, peuvent apprendre ce qu’est réellement la recherche.

Marie-Claude Boiteux a eu la chance d’y participer à une session de formation. Nous vous invitons à en lire  le compte-rendu

« Lundi 10 Mai 2004, 7 h 11, Gare Saint Charles à Marseille, mon train de nuit en provenance de La Rochelle entre en gare. Je m’appelle Marie-Claude BOITEUX et je suis Présidente de l’Association « Cutis Laxa Internationale ». Notre « chauffeur », Roger PICARD, Président de la  Fédération « Huntington Espoir », est là. Il est arrivé hier soir de Metz. Nous avons le temps d’aller prendre un petit déjeuner en attendant l’arrivée du train  de 8 h 25, en provenance de Dijon, qui amène Sylvie CASTELLA, secrétaire de  la Fédération « Huntington Espoir », accompagnée de sa fille Maïlys, lycéenne et bénévole « Huntington Espoir ». Nous sommes rejoints par Claudine MICHELLAND, marseillaise, Administrateur « Huntington Espoir Sud-Est », qui va nous diriger dans les méandres des embouteillages marseillais pour rejoindre le Parc de Luminy où se trouve « l’Ecole de l’ADN ». Là, nous retrouvons Jean-Claude DUTRIPON, marseillais lui aussi, trésorier de l’Association « PXE-France » (PseudoXanthome Elastique).

Il est 9 h 25, nous sommes tous là. Notre grande aventure au cœur de l’ADN et des mystères de la recherche peut commencer sous les directives de nos formateurs Marion MATHIEU et David KARLIN.

Aucun d’entre nous n’a de connaissances particulières dans le domaine de la biologie et de la biochimie. Nous avons glané quelques bribes dans la littérature médicale au cours de nos recherches sur les maladies que nous représentons, mais ce ne sont que des notions. Il nous faut donc commencer par nous familiariser avec le matériel de laboratoire que nous allons utiliser durant ces trois jours : les paillasses sur lesquelles nous allons travailler, les pipettes de différentes contenances (pour ajouter les différents liquides nécessaires en infimes quantités), les tubes à essai, le Vortex  (vibreur électrique utilisé pour bien mélanger le contenu des éprouvettes et nous laisse les doigts pleins de « fourmis »), le bain sec (pour porter le contenu du tube à essai à la température voulue), la centrifugeuse (qui permet de faire déposer au fond de la pipette les éléments les plus lourds),…….. David nous présente également un outil pédagogique qui nous servira de référence durant ces trois jours : une représentation de la double hélice de l’ADN, avec tous ses composants, et qui ressemble étrangement aux colliers de perles emboîtées et colorées de notre enfance. »

Après avoir révisé l’ensemble des éléments qui composent une cellule (noyau, membrane, etc …) et bien remis dans nos têtes que l’ADN se situe sur les chromosomes au cœur du noyau de chacune des cellules de notre organisme, nous pouvons commencer notre première expérience concrète : Nous allons nous « déguiser en  Sherlock Holmes » et  reproduire toutes les étapes d’une analyse de notre propre ADN  en utilisant les mêmes méthodes que la police scientifique (extraction de l’ADN à partir de cellules de la muqueuse de la bouche puis amplification de l’ADN par PCR et visualisation par électrophorèse en gel d’agarose). 

EXTRACTION DE L’ADN A PARTIR DES CELLULES DE LA MUQUEUSE DE LA BOUCHE
Après avoir fait un bain de bouche, nous « crachons » dans un tube à essai que nous mettons dans la centrifugeuse. Les éléments les plus gros et les plus lourds se déposent au fond (c’est le culot). A l’aide d’une pipette, nous prélevons le liquide en surface (le surnageant) qui contient des cellules de la muqueuse de notre bouche.  Puis nous procédons à une PCR.

AMPLIFICATION DE L’ADN PAR P.C.R. : QU’EST-CE QU’UNE  P.C.R. ??????
La PCR ( Polymerase Chain Reaction ou Réaction de Polymérisation en Chaîne) consiste à reproduire in vitro (dans un tube à essai) la duplication de l’ADN qui a lieu lors de la division des cellules. Ainsi, chez l’homme l’ovule fécondé (œuf) subit une cinquantaine de division successives pour donner 2, 4, 8,……. 50 000 000 000 000  cellules tout au long des 9 mois de la grossesse. Chacune de ces cellules contient une molécule d’ADN identique à celle de l’œuf initial (duplication). La PCR consiste à reproduire 40  cycles de duplication successifs en ….. 40 minutes……au lieu de 9 mois………. Cette technique est omniprésente en biologie (dépistage génétique, identification judiciaire, dépistage de bactéries et de virus, typage et identification d’organismes, amplification d’ADN ancien, etc…..)

Bien entendu, suivant les recherches menées, il n’est pas question de copier (amplifier) la totalité de l’ADN, mais seulement une séquence spécifique. Rappelons que les gènes ne représentent que 5% de l’ADN, le reste étant constitué de séquences « intermédiaires » dont on ne connaît pas encore bien les fonctions. Il faut donc connaître d’avance la séquence que l’on veut amplifier. Cela ne peut donc s’appliquer au dépistage génétique que si la séquence du gène muté est bien identifiée. Pour réaliser une PCR, il faut :

                Une polymérase : enzyme (protéine qui a une activité précise) capable de faire un nouveau morceau d’ADN à partir de l’ADN de référence
                Des amorces : courtes séquences d’ADN qui vont délimiter la zone d’ADN à copier, séquences complémentaires à celles du début et de la fin du fragment d’ADN à amplifier.
                Des bases libres : A (Adénine), T (Thymine), G (Guanine), C (Cytosine) , qui sont les « briques » qui servent à construire l’ADN. Suivant l’ordre dans lequel elles sont associées elles permettent la création d’un acide aminé différent : ATC = Méthionine, GGA = Glycine,…….. Chaque protéine est composée de différents acides aminés. Il y a 20 acides aminés différents (sérine, glycine, cystéine, tryptophane,…….). Les bases libres s’associent en paires de bases.
L’EXPERIENCE REALISEE  SUR UNE PETITE PARTIE DU CHROMOSOME 8

1ère  étape : Dénaturation : On chauffe, la molécule d’ADN s’ouvre

2ème étape : Hybridation : les amorces  se collent sur l’ADN

3ème étape : Elongation : on recopie les 2 brins d’ADN grâce à l’ADN polymérase

 La répétition de ces trois étapes permet à chaque fois de fabriquer 2 morceaux d’ADN exactement identiques à l’ADN de départ (ADN de référence). L’amplification est donc exponentielle. En 40 cycles, la séquence est en principe amplifiée mille milliards de fois.

Le fragment d’ADN que nous avons amplifié peut exister sous deux versions (allèles) dans la population (la présence ou l’absence d’une de ces deux versions n’est associée à aucun facteur de risque génétique)  :

            Version courte, d’une taille de 100 paires de bases
           Version longue, d’une taille de 400 paires de bases
Comme nous avons tous deux chromosomes 8 ( un hérité de notre père et un de notre mère), la réaction de PCR sur notre ADN peut donner 3 résultats possibles :

            2 segments courts d’ADN si la personne possède la version courte sur ses 2 chromosomes (homozygote)
            2 segments longs si la personne possède la version longue sur ses 2 chromosomes (homozygote)
            1 segment court et 1 segment long si la personne possède la version longue sur 1 chromosome et la version courte sur l’autre (hétérozygote)
« Jusque là, tout se passe dans les tubes à essai. Nous avons ajouté, grâce à nos pipettes, les différents éléments nécessaires à la réaction chimique, nous avons  « vortexé » les tubes, nous les avons chauffés, centrifugés,….. et nous avons aussi…… attendu….. que  la réaction se fasse à chacune des étapes….attendu aussi…… pour que le temps de chauffe soit suffisant….. Il faut être très attentif et ne pas faire la moindre erreur, jeter l’embout de la pipette et le remplacer par un neuf à chaque nouvelle utilisation, ne pas se tromper de tube à essai. Pour toute nouvelle expérience, les chercheurs doivent, en plus, inscrire systématiquement chaque étape sur un petit cahier d’écolier (combien de micro litres ont été ajoutés, quel produit a été utilisé, le temps de chauffe, le degré de chaleur,…… j’en passe et des meilleurs……..) de façon à pouvoir modifier, même de façon infime, l’un ou l’autre des paramètres, ce qui modifiera le résultat de l’expérience. Nous commençons à comprendre que l’échelle du temps des chercheurs n’est pas la même que la nôtre…….. »

Au cours d’une de ces périodes d’attente nous recevons la visite de Madame Constance HAMMON. Elle est la Présidente de l’Association « L’Ecole de l’ADN » qui nous accueille aujourd’hui, ce dont nous la remercions. Nous évoquons ensemble les difficultés auxquelles sont confrontées toutes les Associations et que chacun d’entre nous connaît bien : la recherche de subventions. Même si aujourd’hui le laboratoire  dans lequel nous travaillons est plutôt bien équipé, il reste encore beaucoup de matériel à acquérir pour permettre d’effectuer l’ensemble des expériences qui se pratiquent dans le domaine de la génétique (microscopes en particulier, ainsi que du matériel pour des ateliers de biologie cellulaire) et dont le prix d’achat est très élevé. Le bâtiment dans lequel se situe ce laboratoire est tout neuf, c’est l’INMED ( Institut de Neurobiologie de la Méditerranée). Il a été financé en partie par le Conseil Général ainsi que la Ville de Marseille. Il est situé au cœur du Campus du Parc de Luminy qui accueille une partie de l’Université ainsi que diverses structures ou organismes à but scientifique comme le Centre d’Immunologie, le Centre de Physique des Particules,….. l’INMED accueille l’Ecole de l’ADN, mais également l’Association « Hippocampe » qui propose des stages de formation pour des lycéens, ainsi que des laboratoires de recherche en neurobiologie (recherches sur l’épilepsie). Quelques locaux attendent encore la prochaine installation de laboratoires de recherche en pharmacologie. Nous apprécions beaucoup ce moment de détente bien sympathique avec ces discussions « à bâtons rompus ».

VISUALISATION DES EMPREINTES PAR ELECTROPHORESE EN GEL D’AGAROSE

Nos tubes à essai sont maintenant prêts. Nous allons pouvoir en visualiser les résultats grâce à un appareil spécial. Il faut d’abord mettre entre deux plaques de verre le gel d’agarose qui va permettre de « filtrer » le contenu des tubes à essai afin de pourvoir « voir », en fonction de leur taille, nos empreintes génétiques.

Nos échantillons sont placés entre deux échantillons de contrôle. Le premier (contrôle +) est celui de l’ADN de David (qui connaît d’avance le résultat qui doit être obtenu), dans le deuxième (contrôle -)  l’ADN est remplacé par de l’eau dans le tube de la réaction PCR. Ces échantillons de contrôle permettent de s’assurer qu’il n’y a eu aucune contamination entre les tubes ni dans les produits qui ont été utilisés et que la réaction a bien fonctionné.

A l’aide de nos pipettes nous glissons une infime quantité du contenu de nos tubes entre les deux plaques de verre, en notant sur une feuille l’ordre dans lequel nous les mettons. Chacun d’entre nous pourra donc savoir s’il est Hétérozygote ou Homozygote. Ces plaques de verre sont installées dans un appareil à électrophorèse. Sous les impulsions électriques l’ADN amplifié va se déplacer et se fixer au niveau correspondant à ses paires de bases.

« Malheureusement, un moment d’inattention et…… le contenu des tubes de Jean-Claude et de Claudine se trouvent mélangés…….. nous les mettons quand même entre les plaques de verre tout en sachant que ce résultat sera faussé…….. il suffit vraiment de très peu de choses pour que tout le travail effectué en amont soit réduit à néant…… Dur ! Dur ! d’être un chercheur… Et il nous faut maintenant attendre…..toujours attendre….. car la réaction met du temps à se faire. Comme il est Midi et demi passés, nous en profitons pour aller déjeuner. Revenus quelques dizaines d’années en arrière pour plusieurs d’entre nous, nous retrouvons les plaisirs gastronomiques du …….. Restaurant Universitaire.

Notre expérience a réussi………. Nous voyons nos empreintes génétiques sur le gel.  Je suis la seule, et pas peu fière de l’être, à être Homozygote Version longue……. Tous les autres sont Hétérozygotes, ………y compris le mélange des tubes de Jean-Claude et Claudine…….

Si nous avions fait une recherche dans le cadre d’une enquête policière, l’échantillon de contrôle+ aurait été celui trouvé sur les lieux du crimes et les autres échantillons, celui de la victime et ceux  des suspects. La comparaison des images du résultat final aurait permis de « superposer » les images et donc d’identifier le criminel. De la même manière, lorsque l’on connaît le gène déficient ou muté d’une maladie génétique cela permet de déterminer si les échantillons examinés portent la même déficience, la même mutation. C’est le cas pour la maladie de Huntington.

14 h 30, nous retrouvons nos « paillasses ». C’est Marion qui nous accompagnera dans nos expériences cet après-midi. Elle nous a concocté un échantillonnage de « recettes » que les « apprentis-chercheurs » que nous sommes vont devoir réussir……. Du moins nous l’espérons. Nous allons devoir introduire le gène, qui code pour la protéine GFP (Green Fluorescent Protein) et qui rend fluorescent,  dans des bactéries (Ichtérias) que l’on trouve naturellement dans nos intestins et qui ne sont donc pas dangereuses pour nous…… Ouf !!!!. Ce gène provient d’une méduse des mers de Chine, Aequorea Macrodactyla, qui produit naturellement la GFP.

Nous allons fabriquer des bactéries transgéniques………. Des OGM (Organismes Génétiquement Modifiés)…… qui pourront elles-mêmes, une fois le gène introduit, produire la protéine GFP……….. Nous commençons à « cuisiner »……… »

COMMENT FAIRE PRODUIRE UNE PROTEINE D’INTERET PAR DES BACTERIES ?

L’ADN est un code universel, les instructions qui y sont contenues sont donc compréhensibles par tous les organismes (vivants sur terre !!!!!! bien sur !!!!!!!……..). Nos petites bactéries n’auront donc aucun problème pour lire les instruction du gène provenant d’une méduse. De la même manière, on peut utiliser des micro-organismes (bactéries, levures, etc…) pour produire des protéines thérapeutiques ( hormones, vaccins, facteurs de coagulation, etc…). Cela permet de s’affranchir des problèmes liés à la difficulté de purifier ces protéines à partir de leurs producteurs naturels (l’homme par exemple), de s’assurer de l’absence de contaminants redoutés (virus, prions en autres) et, pour un industriel, de maîtriser totalement la chaîne de production. C’est pourquoi cette méthode a été l’une des premières envisagées pour le génie génétique.

Après avoir chauffé, puis rapidement refroidi, nos bactéries, créant ainsi un choc thermique, leur membrane s’est fragilisé, permettant ainsi à l’ADN étranger d’entrer. Le morceau d’ADN comprend également un gène de résistance à l’antibiotique qui nous permettra, tout au long de l’expérience, de contrôler notre travail et sélectionner les bactéries qui auront accepté de « loger chez elles » cet étranger     

Ensuite, il faut mettre les boites à l’envers pendant 24 heures dans une étuve à 37° avant de pouvoir visualiser le résultat.

« Pipettes, bain sec, vortex, tubes à essai, boites de pétri sont…… nos  saladiers , nos cuillères, notre  four , nos mixers et nos moules …..

Cultures de bactéries, CaCL², Morceau d’ADN, H²O, milieu de culture sont…… notre farine, notre beurre, nos œufs, notre levure………

Tout l’après-midi nous cuisinons, nous pâtissons,………

Temps de pause pour que le mélange corresponde à la recette……. Dosages infimes…….Précautions particulières………….. tout cela est bien plus précis et compliqué que de faire un petit ragoût « maison » ……. Mais surtout, la cuisson finale est bien longue : 24 heures…….. Ce n’est donc que demain matin que nous verrons si nos « gâteaux » sont réussis……

Il est 17 h 30. Nous sommes bien fatigués après cette journée intense. Nous avons déjà beaucoup appris. Demain le matériel n’aura plus de secrets pour nous, c’est déjà énorme par rapport à ce matin….. Sylvie, Maïlys, Roger et moi décidons de rentrer directement à l’Hôtel où nous dînerons. Les « marseillais » rentrent aussi chez eux…… Joie des embouteillages……. Nous arrivons vers 18 h 30 et décidons de nous retrouver pour le dîner vers 19 h 30. Dès la fin du repas nous regagnons nos chambres, fourbus mais contents, prêts à attaquer notre deuxième journée,….après une nuit de repos bien méritée…..

Mardi 11 Mai , 8 heures, nous nous retrouvons pour le petit-déjeuner, et même si Sylvie a eu une petite « panne de réveil », nous quittons l’Hôtel  presque à l’heure prévue. Hélas, dès la sortie de l’hôtel, les embouteillages nous assaillent. Grâce à « Madame GPS » de la voiture de Roger nous essayons de trouver un autre chemin, mais c’est pas mieux…….. travaux, éboueurs, conducteurs trop pressés,……..tant pis, nous arrivons quand même à bon port, mais avec un peu de retard. Tout le monde nous attend….vite….au travail….. mais notre matinée sera un petit peu « perturbée » par la présence de journalistes (M6 et le journal « la Provence »). En effet, c’est la première fois que l’Ecole de l’ADN reçoit des associations de malades. Cela vaut bien un Scoop. Nous nous prêtons bien volontiers aux interviews, photos et autres séquences  filmées. C’est très important, pour nous aussi,  que l’Ecole de l’ADN soit mieux connue, qu’elle ait un peu de « Pub ». Ce que l’on y apprend nous ne l’apprendrons nulle part  ailleurs et nos adhérents, nos malades ont besoin de ces connaissance, des informations que nous leur retransmettrons, pour mieux comprendre le travail des chercheurs.

Nos retrouvons nos « petits gâteaux » d’hier soir. Ils ont « cuit » toute la nuit et sont fin prêts. Dans chacune de nos quatre boites de piétri nous trouvons les résultats que nous escomptions. »

Nous allons donc pouvoir utiliser la boite contenant les bactéries transgéniques pour nos travaux de ce matin :

PURIFICATION DE LA GFP PAR CHROMATOGRAPHIE HYDROPHOBE

Pourquoi et comment purifier une protéine, tels sont nos sujets de ce matin.

Comme nous l’avons vu hier, les protéines jouent un rôle primordial dans notre organisme. Ce sont elles qui induisent les différentes fonctions de nos organes. Le génome humain compte 30 000 gènes. Chaque gène contient en moyenne 1200 nucléotides (assemblage de protéines) dont chaque protéine est composée, en moyenne, de 400 Acides Aminés (la Huntingtine en compte 3500 !!!!). Le génome humaine est composé de 3 000 000 000 de nucléotides. L’étude des protéines (structure, fonction,……) est donc primordiale dans toutes les recherches génétiques. Pour faire ces études, il est nécessaire de pouvoir disposer d’une grande quantité de la protéine étudiée. Ainsi, dans les expériences que nous avons pratiquées, nous avons fait « fabriquer » de la GFP par des bactéries. Celles-ci, mises en culture, se développent très rapidement. Il faut donc maintenant en extraire (purifier) la protéine pour pouvoir l’étudier. Dans l’expérience que nous menons, nous cherchons à purifier la GFP. Celle-ci est hydrophobe.  Elle n’aime pas l’eau et a tendance à se lier à des supports de type non aqueux ( lipides (graisses), polymères de carbone non chargés,etc..) qui sont eux-mêmes hydrophobes : deux substances hydrophobes ont tendance à s’attirer. Nous allons donc utiliser des billes de plastique (minuscules) recouvertes d’une substance hydrophobe (résine) pour capter et purifier la GFP. Le principe est simple : mettre en présence la GFP et la deuxième substance hydrophobe dans une solution aqueuse chargée en sel (le sel favorise la liaison des deux), puis décrocher (éluer) la GFP en ajoutant …….. de l’eau pure ou presque (sans sel).

Mais………..

La méthode est assez complexe et comporte de nombreuses étapes :

Il faut « Lyser » les bactéries (rompre leur membrane) grâce à une solution (tampon) qui contient du détergent, passer au Vortex pour tout bien mélanger et laisser incuber 15 minutes . Le mélange obtenu s’appelle le « Lysat »
On se débarrasse des gros débris et de l’ADN par centrifugation de 10 minutes, puis on récupère le « surnageant ».
On ajoute à  la GFP un « tampon » de fixation qui a une très forte salinité.
On ajoute ensuite les billes et on laisse incuber 15 minutes
On lave le tout avec un « tampon » de lavage de salinité intermédiaire pour éliminer les contaminants faiblement liés
On ajoute ensuite un tampon d’élution (de décrochage) (en fait c’est de l’eau).
on passe au vortex 
on passe à la centrifugeuse
on prélève le « surnageant » (appelé ici « éluat »)
 

On reproduit les opérations 6 à 9 jusqu’à ce que les billes ne soient plus fluorescentes, c’est à dire qu’il n’y a plus de GFP accroché dessus. Attention de ne pas mélanger les « éluats » obtenus ! A chaque fois , il faut les contrôler grâce à une table à Ultra Violets qui permet de « révéler » la fluorescence.

Il existe aussi d’autres méthodes pour purifier les protéines en fonction de leur taille, de leur charge (électrique) de leur affinité pour une substance donnée : anticorps, ADN, ARN,…..

« Ouh là, là, là,………. Et j’te prends la pipette, et j’t’ajoute un peu de ceci, et j’t’ajoute un peu de cela, et j’te vortex, et j’te centrifuge, et j’te prélève le surnageant……….bref…….. nous ne voyons pas la matinée passer……..passionnés et studieux que nous somme, concentrés sur nos paillasses et nos tubes, à l’affût de la fluorescence…… C’est une traque….. que dis-je ?….. C’est une lutte sans merci… nous allons la capturer cette GFP !!!!!! ………Victoire, à midi sonnant, nous arborons, tout fiers, nos tout petits tubes à essai contenant quelques microgrammes de GFP. La gagnante c’est Claudine, son petit tube brille bien plus que les autres sur la table à U.V.

Nous avons gagné un repas bien mérité…….. au Restau U….comme hier…… mais nous avons faim et bien besoin de recharger nos « stocks d’énergie » pour cet après-midi.

Après une pause-café à la cafétéria de la Fac, nous remontons à l’INMED. Hé Oui !!!  le Parc Scientifique de Luminy est à flanc de montagne. L’INMED est tout en haut et…. le Restau-U et la Cafet ‘…….. ..tout en bas !!!!

La pente est un peu dure à remonter après le déjeuner, mais peu importe, nos paillasses nous attendent………….

14 h 30, David nous attend. Maintenant que nous savons comment purifier une protéine, il peut nous expliquer comment on peut en analyser la structure. »

COMMENT ANALYSER LA STRUCTURE D’UNE PROTEINE ? : LA PROTEOLYSE LIMITEE

En prenant l’exemple de la Maladie de Huntington, nous allons suivre les étapes de cette nouvelle expérience.

Les protéines sont composées d’acides aminés qui s’organisent en régions à la structure compacte (domaines) et en régions flexibles.

La maladie de Huntington est causée par une anomalie de la protéine huntingtine. Chez les personnes atteintes, elle comporte un nombre anormalement élevé d’acides aminés glutamines à la suite les uns des autres, ce qui entraîne son agrégation par un mécanisme inconnu. Pour comprendre ce mécanisme, il faut étudier la structure de la protéine sous sa forme normale, puis sous sa forme agrégée, et de les comparer. La huntingtine est une protéine géante ( + de 3000 acides aminés) qui est composée de plusieurs parties ayant chacune une structure différente, reliées par des parties flexibles. L’une des solutions pour étudier et élucider l’architecture  d’une grosse protéine est de la découper (« protéolyser ») en plus petits morceaux que l’on pourra étudier séparément.

Comme l’analyse de l’architecture de la huntingtine par protéolyse limitée (ou tout autre méthode) est très difficile et relève du domaine de la recherche actuelle, nous analyserons l’architecture d’une protéine plus simple : la nucléoprotéine du virus de la rougeole.

Il faut des « outils » pour découper (« protéolyser ») une protéine, ce sont les « protéases ». Dans notre expérience il s’agira de la Trypsine, extraite du pancréas de bœuf.

Nous allons devoir effectuer des manipulations similaires à celles que nous avons effectuées Lundi matin lors de l’électrophorèse pour visualiser le résultat final de notre expérience. Mais avant cela, il faut préparer nos échantillons.

La recherche se fait souvent par tâtonnements. Nous ne savons pas quelle quantité de trypsine, à quel dosage, protéolysera le mieux notre protéine. Il faut donc « tester » différents dosages pour ne retenir que le meilleur, celui qui protéolysera suffisamment les régions flexibles, sans pour autant détruire complètement les domaines. Par ailleurs, nous disposons d’une solution de Trypsine dont le dosage est fixe. Il nous faut donc commencer par diluer la solution de trypsine afin d’obtenir des concentrations différentes.

Nous avons devant nous 18 tubes à essai : 6 pour chacun d’entre nous, (nous travaillons par groupe de 2 depuis le début du stage de formation) et 6 qui vont servir à faire les différentes concentrations de trypsine.

Les protéines sont tout d’abord dénaturées, c’est à dire complètement « déroulées ». Ensuite elles sont chargées négativement par l’emploi d’un détergent puissant, le SDS. Puis, grâce à un champ magnétique on les fait migrer dans un gel de polyacrylamide qui sépare les protéines les plus petites (qui migrent plus vite) des plus grosses. Cette technique est appelée électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS

Après la migration, le gel est baigné dans une solution de Bleu de Coomassie qui permet de colorer les protéines. Après quelques heures de coloration le colorant excédentaire est éliminé dans une solution de décoloration.

Dans la maladie de Huntington, la huntingtine, qu’elle soit normale ou mutée, est naturellement protéolysée au sein de la cellule par des protéases. On soupçonne que cela favorise l’agrégation de la forme mutée. Comprendre quelles protéases interviennent dans ce procédé (afin peut-être de bloquer leur action ?) et quels morceaux elles génèrent, est donc crucial. Quant à l’architecture de la huntingtine, elle est inconnue….pour l’instant. En effet, elle est très difficile à purifier à partir de cellules, on n’arrive pas à la faire produire par des micro-organismes, de plus, apparemment, elle peut adopter de nombreuses structures différentes au sein de la cellule.

« Alors là !!!…………. Il y a parfois eu comme un vent de panique qui a soufflé sur le labo……..

Tous ces tubes à essai sur la paillasse…….. et il ne faut pas se tromper. D’abord diluer la Trypsine : sachant que nous avons une solution de trypsine dosée à 2000mg par litre et que nous voulons obtenir différentes solutions dosées différemment, comment faire…. Règle de trois, calcul,…c’est ça….non c’est pas ça….. je recommence….ça y est j’y suis…… Cela nous ramène presque aux problèmes de robinets qui fuient et de trains qui se croisent qui ont hanté les devoirs de notre enfance……

Puis ajouter les différentes solutions de trypsine dans les tubes à essai qui contiennent la nucléoprotéine, les identifier suivant le dosage de trypsine, les vortexer, surtout bien penser à changer les embouts des pipettes après chaque utilisation (c’est fou combien on en a utilisé durant ces 3 jours !!!) et surtout ………. Ne pas oublier le léger petit détail qui pourrait tout faire rater…….. les faire chauffer…….. Ensuite il faut, à l’aide d’une micropipette verser, sans trembler, le contenu des tubes sur le gel coincé entre ses deux plaques de verre…….. Ouf……. On y est arrivés !!!!! mais….. patience, patience… et longueur de temps…. Nous n’aurons les résultats que demain matin….. Ben oui, c’est comme ça dans la recherche, on sue, on tremble, on s’échine, on s’évertue à bien faire et puis après on vous dit que les résultats…… ben c’est pour demain …….Attendre…toujours attendre. Et si c’est raté ????…….. ben faudra tout recommencer à zéro, une journée de perdue !!!!!!………. Claudine souffle et soupire…… rude journée.

Nous décidons que cela mérite bien une compensation : nous irons manger une bouillabaisse ce soir, sur le vieux port. Nous prévoyons aussi, si le temps le permet et c’est pas gagné, de pique-niquer demain midi…… Le Restau-U ça suffit…… Nous surveillerons également la presse car l’article de « La Provence » doit paraître dans l ‘édition de Marseille. Quant à M6, ils n’ont pas précisé la date de diffusion du reportage. Nous quittons nos formateurs avant de retrouver les chers embouteillages marseillais. Pendant que Roger aide Claudine à maîtriser un nouveau logiciel sur son ordinateur, Sylvie et moi allons faire les courses pour le pique-nique.

Le Vieux Port nous accueille  vers 20 heures autour  d’une délicieuse bouillabaisse.

Retour à l’hôtel à Minuit et gros dodo. La journée de demain nous réserve encore bien des surprises

Mercredi 11 Mai, Jean-Claude a acheté plusieurs exemplaires de « La Provence ». Le reportage figure en deuxième page. Sylvie, Maïlys, Claudine et Jean-Claude sont à l’honneur sur la photo. David et Marion sont très contents, même si, selon eux, quelques points auraient mérité plus de précisions. Nous attendons Claudine qui est allée chercher Karen FINSTERLE, bénévole Huntington Espoir et infirmière, qui vient partager avec nous cette dernière journée de formation. Et  vite, vite allons au labo …… nous espérons que l’expérience d’hier a réussi et nous avons hâte de contempler les résultats. David nous attend avec la plaque de gel, que c’est beau……. »

Avec des concentrations différentes de trypsine, la nucléoprotéine (525 acides aminés) est progressivement coupée jusqu’à obtenir un fragment résistant d’environ 400 acides aminés. Il n’y a pas d’autre fragment de coupure, ce qui indique que les 125 autres acides aminés ont été complètement digérés. La nucléoprotéine est donc composée d’un fragment très compact (domaine) de 400 acides aminés et d’une région très flexible.

Ce matin nous ne travaillons pas dans le labo. Nous descendons dans la salle de microscopie de l’association « Hippocampe ». Marion a obtenu de ses collègues d’un autre labo le prêt de vers génétiquement modifiés et devenus fluorescents. Nous allons les admirer. Cela ressemble à la Voie Lactée.

Un peu moins « jolie », mais tout aussi intéressante, la petite mouche (drosophile) également fluorescente. Jean-Claude, de main de maître, l’a prise du bout d’un pinceau au fond de son bocal avant de la mettre sur la plaquette.

Nous regardons également des cellules, chacun notre tour.

« Matinée plus « calme », mais nous en avons pris « plein les yeux ». Tant de beauté dans l’optique du microscope….. c’est à peine croyable…… Malheureusement le ciel, quant à lui, n’est pas beau et notre pique-nique tombe à l’eau…… de pluie……. Tant pis, nous nous installons dans la salle de détente de l’INMED :  pain frais, jambon, melon, chips, tomates cerises, petits fromages et fraises accompagnées des « navettes » (petits biscuits provençaux à l’anis) apportées par Marion. C’est un vrai festin.

14 h, l’intervenante de cet après-midi ne peut arriver qu’à 16 h, pour cause de cours donné à la fac. Nous avons donc du temps devant nous. Marion nous propose une ballade dans la (petite) montagne au-dessus du Parc Scientifique de Luminy. Après quelques hésitations, dues à la couleur peu engageante du ciel, nous décidons d’y aller quand même….. un peu d’exercice nous fera le plus grand bien. Ca grimpe un peu, nous n’avons pas tous les chaussures tout à fait adéquates, mais le chemin est bon  et nous montons tranquillement malgré un petit « coup de fatigue » de Sylvie. Merveille !!!!!! arrivés en haut, nous sommes juste au-dessus des Calanques. Que c’est beau !!! Même si le ciel est bien gris et déverse sur nous un petit crachin, la mer est bleue, légèrement turquoise. Nous profitons pleinement de cette vue superbe. Puis nous redescendons tout aussi tranquillement, en faisant bien attention aux rochers rendus glissants par le crachin. C’est le printemps et il y a des fleurs partout : genêts, thym-citron, salsepareille, ….. nous en profitons pour faire un peu de botanique………. »

De retour au Labo nous faisons la connaissance de Madame Nicole PHILIP, praticien hospitalier du département de génétique médicale de Marseille. Elle est spécialiste de la Maladie de Huntington.

De part et d’autre des paillasses nous discutons à bâtons rompus.  Roger et Karen aimeraient bien qu’elle puisse répondre à toutes leurs questions, mais la recherche est en cours, bien des réponses n’ont pas encore été trouvées. Il ne suffit pas toujours d’identifier le gène responsable pour pouvoir envisager des solutions thérapeutiques. La huntingtine est encore trop mal connue. Personne, aujourd’hui, n’en connaît le rôle exact au sein de notre organisme, ni ne sait si on pourrait s’en passer. Même si on peut déjà introduire le gène muté dans l’ADN de l’ovule fécondé d’une souris, il est impossible de supprimer  totalement la huntingtine chez une souris adulte afin d’étudier les conséquences d’une absence totale de huntingtine. En effet, la huntingtine se trouve partout, dans chaque cellule de l’organisme. Comment pourrait-on accéder à chacune des cellules de l’organisme ?

Jean-Claude et moi, concernés par d’autres maladies génétiques, sommes néanmoins très intéressés par ces échanges. Madame PHILIP nous questionne sur les maladies qui touchent nos enfants : la Cutis Laxa et le PseudoXanthome Elastique. Ce sont des maladies qu’elle connaît. Nos témoignages orientent la discussion sur la prise en charge des patients. Madame PHILIP est convaincue qu’il est indispensable que chaque patient, quelle que soit sa pathologie, ait un médecin référant local qui puisse, en cas d’urgence, mettre en place les protocoles nécessaires afin d’éviter  des traitements, voire des opérations,  inutiles, dangereux, parfois entraînant un risque vital. Les spécialistes de ville ne répondent pas aux appels téléphoniques le Samedi et le Dimanche. Les consultations spécialisées trop éloignées du domicile ne permettent pas des prises en charge en urgence.

« Il est 17 h 30. Notre formation s’achève. Notre tête est pleine et riche de tout ce que nous venons d’apprendre durant ces trois jours. Le temps a passé vite, très vite. Nous remplissons nos questionnaires d’évaluation du stage . Il est temps d’échanger nos impressions avec Marion et David. C’est important pour eux que nous leur fassions part de nos critiques (il y en a peu et elles concernent plus la forme que le fond). C’est la première fois qu’ils ont face à eux des Associations de malades (habituellement ils interviennent plutôt auprès de lycéens), et cela les aidera à améliorer le stage.

Quant à nous……. Que dire……. Sinon Merci pour tout : Merci pour ce partage de vos connaissances, Merci pour la chaleur de l’accueil, Merci pour la ballade vers les Calanques………

Nous inaugurons le « Livre d’Or »………. Il est temps de partir……les « Au-Revoirs » s’éternisent …… On reviendra vous voir…… C’est promis………

18 h 30, la voiture démarre, Roger nous ramène. Nous déposons Karen à Lyon, Sylvie et Maïlys à Dijon. A 2 h du matin il me dépose en Seine et Marne et ne retrouvera son lit, à Metz, qu’à 4 heures du matin.

Quant à moi je veux juste ajouter :

Merci Roger de m’avoir proposé d’être associée à ce stage de formation organisé par Huntington Espoir. J’aurais « raté » tant de choses si tu ne l’avais pas fait. Merci aussi d’avoir été un  chauffeur « Hors Pair »……. Jusqu’au bout……

Merci Sylvie d’avoir préparé toute la « logistique » de ces trois jours. Rien à dire, c’était parfait… ;

Merci Claudine, Karen, Maïlys et Jean-Claude d’avoir été d’aussi bons « camarades de classe », dans le sérieux mais avec beaucoup de bonne humeur ;

Merci Marion et David d’avoir été de bons « profs ».

Et tout simplement Merci à « L’Ecole de l’ADN » d’exister. »

P.S. Le reportage a été diffusé sur M6 Marseille le Vendredi 14 Mai dans le « 6 Minutes ».  Il est resté visible sur Internet pendant 5 jours.

Coordonnées

Ecole de l’ADN 
INMED  – Parc Scientifique de Luminy  – 13273 Marseille Cédex 09
email : ecoleadn@agl.univ-mrs.fr   – Tel :  04 91 92 81 45  – Fax : 04 91 82 81 01

Docteur Nicole PHILIP
Hôpital d’Enfant de la Timone –    264 rue Saint Pierre – 13385 Marseille Cédex 05
Email : nicole.philip@ap-hm.fr –  Tel : 04 91 38 66 30  ou 04 91 38 67 34 –
Fax : 04 91 38 46 04 –  Mobile : 06 19 57 82 40

Fédération Huntington Espoir  
20, le Mas au Lièvre  – BP 26  – 57645 Noisseville
Tel & Fax : 03 87 76 61 65  – Email :  sylvie.castella@huntington.asso.fr  

PXE-France
4, impasse des Closeries –   35170 Bruz – Tel : 02 99 57 16 75
Email : jisse.dutripon@wanadoo.fr

Cutis laxa Internationale
35 route des Chaîgnes – 17740 Sainte Marie de Ré – Tel & Fax : 05 46 55 00 59
Email : mcjlboiteux@aol.com